免疫学実習 3、4

ヒト末梢血白血球の分離と、Flow cytometry法によるリンパ球サブセットの計測

 1. ヒト末梢血単核白血球(単核球)の分離と生細胞数の算出

 準備:

 各グループに以下の実験器具と試薬が配布されている。

ヘパリン入り注射針(22G)付きプラスチック注射器(10ml)
酒精綿(70%エタノールを含ませた脱脂綿)
躯血帯
救急絆創膏(バンドエイド)
パスツールピペット 2本
ゴム球(大・小)
リンパ球比重分離液(Ficoll-Paque)入り15ml遠心菅 2本
15ml遠心菅 3本
駒込ピペット 3本
培養用ショートピペット 2本
マイクロピペッター
マイクロピペッター用チップ
0.1%トリパンブルー溶液入りエッペンドルフチューブ
血球計算盤(Burker-Turk)とそのカバーガラス
0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)入りphosphate-buffered balanced salt solution (PBBS)*1
水流式アスピレーター(各実験台の流しに装着)
針捨て容器(ハリポイ)
油性ペン
顕微鏡
遠心機(実習室の窓側と通路側に数台)

 操作:

 1) 採血

 各グループにおいて、供血者1名を選ぶ。

 採血者は供血者の静脈穿刺部位より5cm以上近位に駆血帯をかけ、静脈を怒張・固定させる。この時、供血者は拳をしっかり握る。静脈穿刺部位を酒精綿でやや強くこするように消毒してから採血を行う。注射器に6mlの採血が終了したら駆血帯を外し、すばやく針を抜き、ただちに穿刺部位を酒精綿で圧する。出血がある程度止まったら、救急絆創膏(バンドエイド)を貼る。

 針で手指を刺さないように充分注意しながら注射器の針にキャップを再装着した後、採取した血液とヘパリンを混和させるために注射器を数回転倒させる。

 なお、採血操作に不安があるグループは教員に申し出ること。教員指導の下に採血を行うか、教員が代わって採血を行う。

 2) 血液の希釈

 注射器から針をはずし、専用の容器(ハリポイ)に捨て、採血した血液を注射器から15ml遠心菅に移す。6mlのPBBSを加えて血液を2倍量に希釈する(採血量が6ml以下の場合は、添加するPBBSを増やすことにより、希釈後の液量を12mlに調整する)。希釈血液は駒込ピペットを用いてよく攪拌しておく(この際、泡立てない!)。

 3) 比重遠心法による単核細胞の分離

 あらかじめリンパ球分離液(3ml)が入った遠心菅を2本用意してある。2)で調製した希釈血液の6mlを、各遠心管のリンパ球分離液の上に、パスツールピペットを用いて静かに重層する。この時、分離液と希釈血液の境界面を乱さないように、遠心菅の壁に希釈血液を伝わらせながらゆっくりと重層する。分離液に希釈血液を重層させた遠心菅を遠心機のところまで静かに運び(この時も、液層境界面を乱さないように注意する!)、1500rpmにて30分間遠心する。遠心終了後も静かに遠心菅を取り出す。

 4) 単核細胞の回収

 リンパ球・単球から成る末梢血単核細胞は、血漿(黄色味を帯びる)と分離液(透明)の中間に、白い帯状の層として観察される。一方、赤血球および顆粒球は遠心菅の底に沈む。白い帯状の単核細胞層をパスツールピペットで吸い上げるように回収し、それを新しい15ml遠心菅(細胞洗浄用)に入れる。2本の分離用遠心管から回収した単核細胞浮遊液を同一の洗浄用遠心管にまとめ、それら細胞浮遊液にPBBSを加えて、全液量を12mlにする(遠心管外壁の目盛を参考にしてPBBSを加える)。液を泡立てないように気を付けながら(泡立てると細胞が壊れる)駒込ピペットに液を出し入れして(ピペッティングと言う)よく攪拌した後、1500rpm、10分間遠心することで細胞を遠心菅の底に集める(「ペレットにする」と言う)。遠心後、流しのアスピレーターで上清を吸引除去する(細胞のペレットを吸い込まないように注意)。
 細胞ペレットにPBBSを10ml加えて、駒込ピペットで細胞を丁寧に再浮遊させ(ペレットが完全にほぐれて固まりがないことを確認する)、再び1500rpm、10分間遠心した後、上清を吸引することにより、細胞からリンパ球分離液を完全に洗浄除去する。

 5) 生細胞数の算定

 上清を吸引除去した細胞ペレットに、ショートピペットでPBBSを3ml加え、パスツールピペットを用いて細胞を再浮遊させる(細胞の固まりがなくなるまで十分攪拌!)。
 先端にチップを着けたマイクロピペットで遠心管の細胞浮遊液50μlを取り(浮遊液中の細胞が重力で下に沈まないよう、素早く操作する)、エッペンドルフチューブに移し、このチューブにあらかじめ入れてある0.1%トリパンブルー溶液(50μl)と細胞浮遊液を、ピペッティングにより丁寧に攪拌する。
 Burker-Turk血球計算盤にカバーガラスを載せ、計算盤とカバーガラスの隙間に、マイクロピペットでトリパンブルー液と混ぜた細胞浮遊液を入れる(毛細管現象で吸い込まれていく)。計算盤とカバーガラスの隙間に入れる液量として、およそ7lが適量であるが、カバーガラスの着け方(計算盤との位置関係)によっては、その液量を微調整する必要が生じる。過剰の液量を入れてカバーガラスが浮き上がってしまったり、細胞浮遊液が目盛のある面の周囲の溝にまで漏れ出してしまうと失敗である。逆に、液量が少なすぎて細胞浮遊液が目盛の上にまで至らない時には、さらに細胞浮遊液を計算盤とカバーガラスの隙間に入れる。液量が適当であれば、計算盤とカバーガラスの密着面にニュートンリングが確認できる。
 Burker-Turk計算盤を顕微鏡に載せ、コンデンサーの絞りを絞って目盛が見えるようにする。このタイプの血球計算盤には、右の図のように一辺1mmの正方形が9つある。細かく区画された中央の正方形は赤血球を数えるのに使う。今回は白血球を数えるので、四隅にある区画の大きい正方形のどれか一つを使う。外側を区画する三重線の一番外までが1mmの辺であることに注意する。
 1mm四方の正方形の中に含まれる細胞数を数えるが、青く染まっているのは死細胞、丸く透明に見えるのが生細胞である。1mm四方中の生細胞数と死細胞数の両方を数えよ。
  計算版の目盛面とカバーガラスの間の隙間は0.1mmになるように作られている。従って、ここで数えた細胞の数は、底面が一辺1mmの正方形で、高さが0.1mmの直方体に相当する体積の浮遊液中にある細胞数となる。

 6) 細胞浮遊液の濃度調整

 上で計算した細胞密度を基に、最終的な細胞濃度が1.0 X 106個/mlになるように、細胞浮遊液にPBBSを加えて調整せよ。必要であれば新しい15ml遠心管を使用せよ。
 調整済み細胞浮遊液はグループの番号を記入した上で冷蔵庫に保存する。

 参考

 1) phosphate-buffered balanced salt solution (PBBS)

 組成:
NaCl        7.20 g
KCl         0.320 g
Na2HPO4    1.15 g
KH2PO4    0.20 g
CaCl2      0.140 g
MgCl2・6H2O   0.20 g
MgSO4・7H2O   0.20 g
グルコース    1.00 g
フェノールレッド  0.010 g
精製水で総量を 1リットルとする。

 生体の細胞外液とよく似た組成で、十分量の2価イオンが含まれており、生きた細胞に対する傷害性が極めて少ない平衡塩類溶液。一般のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline: PBS)はその中に生きた細胞を長く保っておくのには適さない。また、同じ平衡塩類溶液の一つであるハンクス液(Hanks' balanced salt solution)は pH の安定性に乏しい。PBBS は作製がやや面倒だが細胞傷害性が極めて少なく pH の安定性も良い、理想的な平衡塩類溶液である。

 2. 蛍光抗体染色と Flow cytometerによるリンパ球サブセットの染め分けと陽性細胞割合の算出

 目的:

 リンパ節・脾臓などの免疫組織や末梢血中には、それぞれ異なる機能を持った複数種類の免疫細胞が存在する。それらにはリンパ球、形質細胞(plasma cells)、マクロファージ、樹状細胞、顆粒白血球(好中球・好酸球・好塩基球)などがあり、リンパ球は更に抗体産生能を持つBリンパ球と、細胞性免疫反応に関与するTリンパ球に分けられる。Tリンパ球の中には、 MHC class I 分子の上に提示された抗原ペプチドを認識する CD8 陽性T細胞(主に細胞傷害性T細胞に相当する)と、MHC class II 分子上に提示された抗原ペプチドを認識する CD4 陽性T細胞(主にヘルパーT細胞に相当する)とがあることも、講義で詳しく述べた通りである。
 形質細胞やマクロファージ、それに顆粒白血球は、それらの特徴的な形態によって無染色の標本や通常の組織標本上でもある程度区別可能であるが、リンパ球は全く特徴のない球形の細胞で(昔は「小円形細胞」と呼ばれた)、形を見ただけではその機能は全く予測不可能である。そこで、形の上では区別不可能だがお互いに全く異なる機能を持つ細胞群を明確に区別するために、「細胞表面マーカー」が利用されるようになった。各細胞群の機能に直結した分子を、その分子に特異的に反応する抗体によって検出出来れば理想的であるが、実際には、最初は先ず特定の細胞集団をその他の細胞集団から区別する抗体が出来、後にその抗体の反応する分子の機能が判ったと言う例も多い。例えば、マウスでは以前 Thy-1と呼ばれる抗原がTリンパ球のマーカーとして使われていたが、この分子はTリンパ球と(何故か)神経細胞に強く発現しており、脂質のアンカーによって細胞表面に結合している。しかし、その機能は未だに不明であり、ヒトに於ける対応分子も明確ではない(胸腺のTリンパ球前駆細胞に発現する CDw90 分子?)。

 今回の実習では、ヒト末梢血のBリンパ球と CD4及び CD8陽性Tリンパ球を、その機能に直結した細胞表面分子、即ちCD19と CD4, CD8分子そのものを用いて染め分け、その数を数えてみよう。

 原理:

 Bリンパ球表面に発現しているCD19分子、およびTリンパ球の表面に発現している CD4及び CD8 分子を、これらと特異的に反応するモノクローナル抗体で検出する。特異的に結合した抗体の検出法には、蛍光を利用するもの(蛍光抗体法、FACS 法)、酵素反応を利用するもの、ラジオアイソトープを利用するものなどがある。酵素抗体法を利用して抗体の結合した細胞に色を付る方法は、組織切片の染色に利用されるが(「免疫組織化学」と呼ばれる)、今回は蛍光色素で標識した抗体を用い、Flow cytometerで陽性細胞数と各細胞の蛍光強度を測定してみよう。この方法は、例えば HIV感染者の免疫機能検査で末梢血の CD4陽性細胞数を調べる場合に用いられているものと同じである。

 フローサイトメーターとは:

 フローサイトメーターは、細胞の均一な浮遊液より、浮遊物(細胞)の光学特性を測定する機器である。細胞は液流に乗ってレーザー光の焦点を通過するが、その通過時に毎秒 500-4,000個の細胞より前方散乱光、側方散乱光、及び3つの異なる波長の蛍光の計5種類の光学特性を、個々の細胞について同時に測定し、それら細胞のの大きさ、内部構造、及び細胞膜・細胞質・核内に存在する種々の抗原或いは核酸量等の、生物学的特性を迅速、かつ正確に測定することができる。
 散乱光とは、レーザーが細胞に当たって周囲に散乱した光である。前方散乱光 (Forward Scatter: FSC) はレーザー光軸に対して前方で検出し、散乱光強度は細胞の表面積に比例する。すなわち、相対的に FSCの値が大きければ細胞も大きく、FSCの値が小さければ細胞も小さいと考えられる。側方散乱光 (Side Scatter: SSC) はレーザー光軸に対して90度(直角)の位置で検出し、細胞の顆粒や細胞内構造の状態に散乱光強度が比例する。すなわち、相対的に SSCの値が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、SSCの値が小さければ細胞の内部構造は単純であると考えられる。

 左の図にFSCをX軸に、SSCをY軸にとったドットプロットの例を示す。各細胞は図の中の一つのドット(点)で示されており、それらの位置は、FSCとSSCの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。今回の実習では、この画面でリンパ球のデータだけを抽出し解析するように設定する。

 一方、蛍光とは、細胞に標識されている蛍光色素が照射されたレーザー光によって励起され、エネルギーを放出する際生じた光を言う。今回使用するフローサイトメーター(製品名: Becton & Dickinson FACSCalibur)は、488nmの単一波長レーザー光を照射する。細胞はそれ自体も弱い蛍光を発する性質を有しているが(自家蛍光)、実際に細胞の持つ分子を蛍光を用いて特異的に検出しようとする場合は、あらかじめ何らかの形で細胞或いはその持つ分子に蛍光色素を結合させる必要がある。例えば、FITC (Fluorescein isothiocyanate) は、488nmの励起光を吸収し、主に 530nmの蛍光(緑色)を発する。抗体にあらかじめ FITCを標識しておけば、細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果 FITCの蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。今回用る FACSCaliburは、異なる蛍光波長域を検出できる3本の蛍光検出器を搭載しており、異なった波長の光を発する複数の蛍光色素を用意しておけば、最大3つの異なる抗原を同時に検出することが可能である。FITC以外の蛍光色素として PE (Phycoerythrin) は主に 585nmの蛍光(オレンジ色)を発し、PerCPや Cy5-PEは主に 680nmの蛍光(赤色)を発する。これらの蛍光色素が種々の抗体と組み合わされ、細胞の二重染色や三重染色に用いられる。

 ヒストグラム:

 フローサイトメーターを用いた蛍光測定において、各パラメーターの光信号の強度を X軸に、細胞数を Y軸にとったグラフをヒストグラムと言う(図)。この例はヘルパーT細胞の細胞表面機能分子(MHC class II 分子レセプター)である CD4に対する抗体に蛍光色素の FITCを結合させ、細胞集団中の CD4陽性細胞数を調べている。調べた全細胞のおよそ 17%が CD4陽性細胞であるとわかる。この場合、総計で1万個以上の細胞を計数しているが、肉眼では勿論このように多数の細胞を計測することは不可能である。

 二種類の蛍光色素の蛍光強度をX軸とY軸にとったドットプロット:

 二重染色や三重染色をした場合には、それぞれの蛍光強度を X或いは Y軸におき、個々の細胞が二次元グラフ上の一つ一つの点に対応するような表示方法を用いて解析する。
 図に示す例では、脾臓細胞の集団を FITCで標識した抗 CD8 抗体と PEで標識した抗 CD4抗体で同時に染め、CD4 陽性細胞数と CD8陽性細胞数を求めている。左下の区画に見える集団は CD4, CD8共に陰性の細胞群で、ここでは全体の約 55%を占める。CD4陽性細胞がおよそ 8%、CD8陽性細胞がおよそ 5%であることもわかる。

 準備:

 各グループに以下の実験器具と試薬が配布されている。

昨日の 1.で作成したヒト末梢血単核細胞浮遊液(1 106/mlに調整済み)入り15 ml遠心管
FITC標識抗ヒトCD4抗体(10μg/mlに調整済み)、50μl
PE標識CD8抗体(10μg/mlに調整済み)、50μl
FITC標識CD19抗体(10μ/mlに調整済み)、100μl
0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)入りリン酸緩衝平衡塩類溶液 (PBBS)
マイクロピペッター
マイクロピペッター用チップ
エッペンドルフチューブ 2個
ショートピペット 1本
パスツールピペット 2本
駒込ピペット 2本
水流式アスピレーター(各実験台流しに装着)
エッペンドルフチューブ用マイクロ遠心機 (窓側実験台に用意)
油性ペン
氷入り発泡スチロール箱

 操作:

 1) エッペンドルフチューブの蓋にA、Bと記入し、前日作成した末梢血単核細胞の浮遊液をそれぞれのチューブに1mlずつ入れる(1チューブあたり1 X 106個の細胞が入ることになる)。マイクロ遠心機にて3,000rpm、3分間遠心して、細胞ペレットを残して上清のみを吸引除去する(ペレットが見えにくいので注意して吸引すること!)。

 2) Aと記入したチューブに、先端にチップを着けたマイクロピペッターで抗 CD4抗体液を 50μl添加し、その同じチップのままでピペッティングにより(泡を立てるな!)、細胞を再浮遊させる。次に、マイクロピペッターのチップを新しいものに交換し、同じチューブに抗 ヒトCD8抗体液を 50μl添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌混合する。その後、チューブは氷上に置いて抗体を細胞に結合させる。

 3) Bと記入したチューブにマイクロピペットで抗ヒトCD19抗体液を 100μl添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌する。チューブを氷上に置く。

 4) チューブを氷上においてから30分が経過したら、それぞれのチューブに駒込ピペットで PBBSを 1 mlずつ加え、マイクロ遠心機にて 3,000rpm、3分間遠心して、上清を吸引除去する。

 5) 細胞ペレットのみを残して上清を吸引した各チューブに、先端が細胞に触れないように注意しながら駒込ピペットで PBBSを 1 mlずつ加え、パスツールピペットを使って Aのチューブの細胞に液を吹きかけるようにして丁寧に浮遊させる。次にパスツールピペットを新しいものに換えて、Bのチューブの細胞を浮遊させる。マイクロ遠心機にて 3,000rpm、3分間遠心し、上清を吸引除去する。

 6) 細胞ペレットのみを残して上清を吸引した各チューブに、先端が細胞に触れないように注意しながら駒込ピペットで PBBSを 0.5 mlずつ加える。チューブを氷上に置き、氷の容器ごと実習室教壇前の実験台に移動する。

 [ここから先の操作は教員が行う。学生は教員の操作をよく見て解説を聞くこと。]

 <実習室教壇前実験台での操作>

 7) 細胞の浮遊液を目の粗いフィルターに通過させ、細胞の凝集塊などの大きなかたまりを除くと同時に、細胞浮遊液をフローサイトメーター解析用チューブに移し、蓋をする。再び細胞浮遊液の入ったチューブを氷上に置き、氷の容器ごと持って、研究棟 II(新棟)10階の部屋番号10-Aに移動する

 <研究棟 II(新棟)10階の部屋番号10-Aでの操作>

 8) フローサイトメーターによって 10,000個の単核細胞を解析し、データ解析ソフトウェアCellQuestR を用いて染色データを可視化する。チューブAは FITCと PEとの2重染色なのでドットプロットで解析し、CD4陽性細胞とCD8陽性細胞の割合を調べる。チューブ Bは単染色なのでヒストグラムで解析し、細胞表面 CD19陽性細胞の割合を調べる。

 教員の説明を聞き、データのプリントアウトを受け取って、レポートを書く。